Szkolenie online, autor: dr Jan Żak

Wszystko, co powinniśmy wiedzieć o koronawirusie
i testach

„Pacjent zero”

Jest koniec 2019 roku, miasto Wuhan w środkowych Chinach. Pierwszy, 55-letni pacjent choruje na ciężkie zapalenie płuc o nieznanej etiologii. Potem następny i kolejny. Świat obiega informacja, że grozi nam globalna pandemia. WHO alarmuje. Rządy wszystkich krajów podejmują radykalne decyzje, by chronić swoich obywateli. We Włoszech rozgrywają się dantejskie sceny, ale pierwsza fala epidemii w Polsce jest na szczęście łagodna. Swoje żniwa wirus zbiera tu dopiero jesienią 2020 roku. 

Podczas gdy świat liczy każdy stwierdzony przypadek koronawirusa (np.: do 11 listopada 2020 roku zachorowało 51 865 619 osób, zmarło 1 280 592), naukowcy nie poddają się i badają jego strukturę oraz właściwości. 

Jako ludzkość dokonaliśmy rzeczy nieprawdopodobnych w najkrótszym dotychczas czasie w historii. 

Czy będzie zbiorowa Nagroda Nobla za ustalenie struktury proteiny-S SARS-CoV-2?

Największym przełomem w badaniach był rekordowo szybki czas, w jakim wirusolodzy zaczęli dysponować pełną strukturą charakterystycznej proteiny-S nowego wirusa. Po pierwszej epidemii SARS-CoV-1 podobne materiały były dostępne po… trzech latach. Teraz czasopisma medyczne opublikowały za darmo (co się wcześniej nie zdarzało) informacje po niespełna miesiącu. Każda osoba na świecie może z nich korzystać. 

Choć wciąż są osoby, które nie wierzą w pojawienie się nowego wirusa, naukowcy mają dowody na jego istnienie: RNA, swoiste objawy u pacjentów i jego zdjęcia wykonane mikroskopami elektronowymi (Transmission electron microscopy, TEM). Całą tę wiedzę uzyskali w niespełna miesiąc od wybuchu epidemii. Udało się to dlatego, że do badań nad wirusem włączyli się ludzie ze wszystkich kontynentów. Powstał wręcz globalny ruch. To nie tylko opanowanie procesu krystalizacji (o nim szczegółowo piszemy poniżej), ale też miliony ludzi na świecie, które udostępniały swoje komputery (czyli logowały się na stronę, dzięki której dodawały GB do obliczeń). Tak powstał wspólny światowy komputer, który z ogromną mocą liczył, jak wygląda struktura proteiny-S SARS-CoV-2 (czyli tej proteiny, której koronawirus zawdzięcza swoją nazwę, ponieważ przypomina kolce). Ta proteina może być zbudowana nawet z 1000 aminokwasów. W jaki sposób one się układają? Jak tworzą strukturę? Już to wiemy!

To jest kosmos! Osiągnięcie o randze Nagrody Nobla. W SARS-CoV-2 proteiny są membranowe, nie są w środku komórki, nie jest więc tak łatwo je skrystalizować. To majstersztyk – mówi dr Jan Żak.

Doktor Jan Żak z wykształcenia jest biofizykiem, lekarzem, który tłumaczy meandry testowania koronawirusa. Jest ekspertem nauk podstawowych, absolwentem nauk biomedycznych Uniwersytetu w Guelph oraz biofizyki Uniwersytetu w Toronto (Princess Margaret Cancer Center). Obecnie pracuje z prof. Mariuszem Zimmerem w II Katedrze Ginekologii i Położnictwa w Uniwersyteckim Szpitalu Klinicznym przy ul. Borowskiej we Wrocławiu.  

(Ciekawostka: Istnieją wirusy, które mają DNA, jak np. wirusowe zapalenie wątroby typu B, ale np. wirusowe zapalenie typu C, tak jak HIV i koronawirus, ma genom składający się z RNA)

Zrozumieć geniusz naukowców

Zacznijmy od podstaw. Proteiny są zbudowane z łańcucha aminokwasów. Różne proteiny mają rozmaite domeny, które pełnią wielorakie funkcje. Dla biologów kluczowe jest więc poznanie ich struktury. 

90% protein, których strukturę ludzkość poznała, są to tzw. cytosolic, czyli proteiny, które znajdują się w środku komórki, w jej płynie. Te mikroskopijne proteiny dają się prosto namnażać (amplifikować) i łatwo z nich stworzyć skoncentrowany roztwór. Po odparowaniu oraz przy odrobinie szczęścia nasza proteina może utworzyć mały kryształ. Posługując się tą samą metodą, której James Watson, Francis Crick oraz Rosalind Franklin użyli do odkrycia struktury DNA, można też ustalić strukturę skrystalizowanej proteiny. 

To jednak nie dotyczy koronawirusa. W przypadku SARS-CoV-2 proteina nie znajduje się w środku komórki, ale w jej membranie, na zewnątrz. Nie możemy więc stworzyć roztworu przypominającego rosół, który umożliwia łatwiejszą krystalizację. Tu proteiny mają dodatkowo pierścieniowe lipidy i membrany. W momencie wypłukania protein z membrany właściwie od razu dochodzi do denaturacji.

Do krystalizacji protein membranowych używa się syntetycznych, stabilizujących lipidów (przykładowa nazwa takich lipidów: Triton-X-100). Lipidy krystalizują się wraz z proteinami. Tworzą surrealistyczne struktury przypominające chaotyczne formy geometryczne.

Proteiny mają różne kształty: pętelki, serpentyny, paski, kulki. Mają też swoje domeny. Jednak w wyniku denaturacji tracą strukturę. Znamy więc tylko sekwencję ich aminokwasów. Kunszt polega na tym, by proteina się krystalizowała bez utraty swojej struktury. Dlatego mówi się, że to już nie jest nauka, ale wręcz ekstremalnie wymagająca sztuka. 

Wykorzystuje się do tego metodę X-ray krystalografii. To ta sama metoda, która w XX wieku została wykorzystana do odkrycia struktury DNA. Teraz w analogiczny sposób zidentyfikowano strukturę proteiny-S. 

I choć nadal wydaje się to łatwe, to warto dodać, że istnieją proteiny, które przez 10 lat próbujemy wykrystalizować i to się nie udaje. Przez to, że jest to tak skomplikowany proces, niektóre proteiny nigdy nie stworzą kryształu, a tym bardziej te membranowe.  

Na naszych oczach dzieje się coś niewyobrażalnego – gdy ludzkość jednoczy siły, może dokonywać rzeczy, które kiedyś wydawały się wręcz nieosiągalne w tak krótkim czasie. 

Dzięki temu, że znamy strukturę proteiny-S, wiemy z jakimi receptorami się łączy oraz jakie off-label substancje mogą leczyć COVID-19. Ta wiedza pozwala na zaprojektowanie leczenia i opracowanie szczepionki. A przede wszystkim możemy projektować primery, które wykrywają RNA wirusa. 

Nasza misja

Testując, szybciej pokonamy wirusa

Ciekawostka: dlaczego mydło i alkohol są groźne dla koronawirusa?

Zarówno komórka, jak i wirus mają membranę. Membrana oddziela wnętrze komórki od zewnątrz. To właśnie dzięki membranie komórka może kontrolować poziomy jonów oraz substancje, które do niej wchodzą i z niej wychodzą. W przypadku wirusa jest to jeden z mechanizmów ochrony genomu. 


Koronawirus ma membranę lipidową (czyli złożoną z tłuszczów). Mydło i alkohol łatwo rozpuszczają taką membranę i powodują, że dochodzi do denaturacji protein wirusa oraz rozłączenia się jego RNA z chroniącą go nukleoproteiną (proteiną-N).

Sprytny wirus z koroną

Wirus udaje małą komórkę. Przypomina lipidowy bąbelek, który łączy się z komórkami posiadającymi receptor ACE2 na swojej membranie. Trzeba przyznać, że robi to znakomicie. Zauważmy, że nie tworzy silnej reakcji immunologicznej we wczesnej fazie infekcji. A to oznacza, że nasze organizmy nie traktują wirusa jako wirusa. Reakcja interferonowa, czyli reakcja antywirusowa, w tym przypadku jest znacznie mniejsza w porównaniu z SARS-CoV-1 z 2003 roku. Za to w kolejnym stadium choroby często powstaje bardzo silna reakcja, tzw. burza cytokinowa, która bezpośrednio zagraża życiu pacjenta. 

Co wiemy o koronawirusie? Objawy.

Wirus SARS-CoV-2 należy do grupy koronawirusów. Wywołuje chorobę układu oddechowego COVID-19. Przenosi się drogą kropelkową. U około 13% populacji wywołuje ciężkie zapalenie płuc i ARDS.  Objawy: 
  • Gorączka 87,9%
  • Suchy kaszel 67,7%
  • Zmęczenie 38,1%
  • Duszność 18%
  • Utrata węchu i smaku (całkowita lub wybiórcza, na szczęście odwracalna, wynika z tego, że wirus najpierw atakuje komórki podporowe, które są częścią nabłonka węchowego)
Rzadziej występujące objawy to: katar, ból głowy, ból gardła, odkrztuszanie flegmy, bóle mięśni i stawów, dreszcze, nudności i/lub wymioty, rozwolnienie.
W ciężkich przypadkach: wysoka gorączka, odkrztuszanie krwi, zmniejszona ilość leukocytów, niewydolność nerek.
Niemal 90% osób przechodzi koronawirusa bezobjawowo lub skąpoobjawowo, ale zaraża innych. Skąd wiemy, że jesteśmy chorzy na koronawirusa, a nie na grypę?
Jak sprawdzić, czy jesteśmy chorzy na koronawirusa? Jaki wybrać test? Który rodzaj testów jest skuteczny? 
Niniejsze opracowanie ma na celu usystematyzowanie wiedzy o testach na koronawirusa. Jest to wiedza zaawansowana, ale pomocna w zrozumieniu specyfiki testowania.

Czy testy na koronawirusa są wiarygodne?

 

Tak zbudowany jest koronawirus.

Dr Jan Żak w przystępny sposób tłumaczy, że w budowie wirusa wyróżniamy trzy ważne fragmenty jego genomu, które zostały zaznaczone na obrazku na czerwono. Są to:

 

1. ORF1a (open reading frame) – obejmuje ok. ⅔ genomu, koduje wiele protein oraz tzw. proteazy (np. proteina-PL zapobiega degradacji komponentów wirusa; wiemy to, gdyż podobna proteina istnieje w wirusie SARS-CoV-1, co zostało zbadane podczas pierwszej epidemii). Patrząc tylko na sekwencję RNA, ORF1a jest specyficzny i charakteryzuje tego wirusa.


Ciekawostka: Genom wirusa jest długi – to 30 tys. kb, potrzebne są więc enzymy tnące długie polipeptydy na wyprodukowane przez każdą część tego genomu. Te proteiny pełnią różne funkcje. Wspomnieliśmy o: proteinie-S i proteinie-N, ale w samym wirusie jest ich znacznie więcej. To, że wirus tworzy lipidowe bąbelki, to jest właśnie zasługa protein.

2. S, czyli Spike – glikoproteina powierzchniowa, czyli proteina z cukrowym łańcuchem. Są to kolce specyficzne dla tego wirusa, które cechują całą klasę koronawirusów. Można tę proteinę przyrównać do odcisku palca człowieka – jest tak charakterystyczna. Jednak w przeciwieństwie do odcisku palca, proteiny bardzo często mutują. Powstanie problem, gdy organizm ludzki uodporni się na jeden szczep wirusa, a na drugi nie.

Tak jest właśnie z wirusem HIV. Jednym z powodów braku szczepionki jest to, że membranowe proteiny nieustannie się zmieniają.

Mutacje są też przyczyną tego, że co roku musimy szczepić się na grypę – epitopy H i N też mutują.

Istnieje więc zagrożenie, że mutacje SARS-CoV-2 spowodują brak skuteczności nowych szczepionek. Jest też nadzieja, że skoro mobilizacja świata do pokonania tego wirusa jest tak szybka, to w krótkim czasie będzie można stworzyć kolejne szczepionki.

Ponieważ proteina-S jest epitopem, z którym stykamy się najwcześniej, to właśnie na ten fragment wirusa nakierowana jest szczepionka.

3. Białko nukleokapsydu N – to najważniejsza część wirusa. Tworzy nukleokapsyd, który chroni genom przed degradacją.

Wysoka immunogenność tej molekuły może świadczyć o tym, że jako ludzkość zmagaliśmy się z nią na tyle długo, że nasze systemy odpornościowe wyprodukowały lepszy system jej wykrywania. Służy ona ochronie komórek przed kwasami nukleinowymi, które wnikają w nie i replikują. Ta część wirusa bardzo rzadko mutuje. Proteina-N występuje w najwyższym stężeniu ze wszystkich protein wirusa.

Rodzaje testów na koronawirusa

Testy różnią się nie tylko metodą i czasem wykonywania, ale też każdy z nich reaguje na inny fragment genomu wirusa. Może to być odpowiednio: gen (ORF1a), białko (proteina-N) albo przeciwciała skierowane, np. przeciwko proteinie-S.

Posiadając tę wiedzę, będzie można łatwiej nie tylko podjąć decyzję o tym, którego testu użyć, ale także zrozumieć specyfikę każdego z nich.

  • Najbardziej czuły z czułych testów. Test genowy qRT-PCR
  • Test, który dogania w czułości. Test antygenowy II generacji
  • Test post factum. Test immunologiczny

Test genowy PCR. Nie powie, czy pacjent zaraża

Reakcja łańcuchowa polimerazy (Polymerase Chain Reaction)

W 1993 roku Kary Mullis dostał Nagrodę Nobla za to, że osiem lat wcześniej wymyślił powielanie DNA przez wykorzystanie do tego enzymu katalizującego jego syntezę, czyli właśnie polimerazę DNA. Jest to ważne szczególnie w sytuacjach, gdy występuje mało materiału genetycznego.

Dr Jan Żak tłumaczy:

  • Nie ma takiego testu PCR, który działa na SARS-CoV-2.
  • COVID-19 wywołuje wirus, którego genom składa się z RNA.
  • Test PCR działa wyłącznie z DNA.
  • Żeby pracować z fragmentami genomu koronawirusa, musimy użyć enzymu odwrotnej transkryptazy (reverse transcriptase, TR), który zmieni RNA w komplementarną cDNA.
  • Test PCR pokaże, czy dana molekuła istnieje, ale nie czy pacjent jeszcze zaraża wirusem.
  • Pojawiają się wyniki fałszywie dodatnie i fałszywie ujemne.
  • Pod pewnymi względami jest to więc podstępny test. Polimeraza w nim nie jest taka, jak w naszych komórkach. Ona nie ma tzw. proofreading ability. Jak coś napisze, to nie ma mechanizmu sprawdzającego, czy dobrze dopasowała nukleotydy. Pojawiają się więc błędy. Dlatego robi się test PCR do ok. 40 cykli, ponieważ później błędy się już geometrycznie nakładają.

Najbardziej czuły z czułych testów. Testy genowe qRT-PCR

Co możemy zrobić? Powinniśmy używać testów tzw. qRT-PCR (Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR). Na czym polega różnica?

Ten test pokaże nie tylko, czy molekuła DNA istnieje, ale też w jakiej ilości.

Jak to działa?

  • Pamiętajmy: koronawirus ma RNA, test PCR pracuje tylko z DNA, musimy więc zamienić RNA na cDNA.
  • Najpierw musimy wiedzieć, jakiej części DNA szukamy. Wiemy to dzięki temu, że naukowcy w ekspresowym tempie poznali sekwencję genomu wirusa.
  • Wiedząc, jakiego fragmentu DNA szukamy, tworzymy primery o długości ok. 20 nukleotydów.
  • Jeśli jesteśmy zarażeni koronawirusem, to owe primery będą się łączyły z odpowiadającą im częścią cDNA i wtedy będziemy mogli ją replikować (amplifikować) in vitro.
  • Primery przyklejające się do fragmentu cDNA mają fluorofor. Primer połączony z DNA uwalnia barwnik, używając polimerazy taq. To barwnik, który pod wpływem ekscytacji laserowej wytwarza światło o fali, którą można zmierzyć. W jednej reakcji możemy badać dwa, a nawet trzy różne barwniki wytwarzające inne fale.
  • Owe primery szukają ORF1a i proteiny-N.
  • W efekcie, jeżeli w wygenerowanej cDNA znajdzie się fragment połączony z primerem, to będzie można go geometrycznie powielać. Maszyny potrafią zmierzyć ten sygnał.
  • Aby móc namnażać DNA, wykonywanych jest kilka cykli, które polegają na podgrzewaniu i ochładzaniu probówki.
  • Po pierwszym cyklu PCR jest bardzo mały sygnał, po dwóch cyklach już mamy cztery razy więcej DNA. Po trzech już mamy 8 egzemplarzy DNA itd. Po pewnym czasie osiągamy tzw. cykl graniczny (cycle threshold, cT), kiedy reakcja dochodzi do płynnej dwukrotnej amplifikacji DNA.

Ciekawostka: Gdy Donald Trump zaraził się koronawirusem, media podawały, że prezydent jest chory, ale zdrowieje. Dlaczego? Pozwoliło to stwierdzić badanie cT – na początku było cT 15, za 2 dni cT 20, a za 3 dni 25. Ilość wirusa w próbkach się zmniejszała.

Dlaczego to jest ważne?

Dr Jan Żak: – Ponieważ możemy porównać cT różnych pacjentów i różnych próbek. Gdy dzwonią z laboratorium i mówią, że pacjent ma niejednoznaczny wynik, to pytamy: Jaki ma cT? Jeśli to jest cT 36 albo 38 czy 39, to nie martwimy się aż tak, jak gdyby powiedzieli, że cT jest 32. Nie zmienia to faktu, że jakikolwiek dodatni wynik testu qRT-PCR świadczy o potencjalnym istnieniu RNA wirusa SARS-CoV-2.

Ciekawostka: Gdy Donald Trump zaraził się koronawirusem, media podawały, że prezydent jest chory, ale zdrowieje. Dlaczego? Pozwoliło to stwierdzić badanie cT – na początku było cT 15, za 2 dni cT 20, a za 3 dni 25. Ilość wirusa w próbkach się zmniejszała.

Dlaczego to jest ważne?

Dr Jan Żak: – Ponieważ możemy porównać cT różnych pacjentów i różnych próbek. Gdy dzwonią z laboratorium i mówią, że pacjent ma niejednoznaczny wynik, to pytamy: Jaki ma cT? Jeśli to jest cT 36 albo 38 czy 39, to nie martwimy się aż tak, jak gdyby powiedzieli, że cT jest 32. Nie zmienia to faktu, że jakikolwiek dodatni wynik testu qRT-PCR świadczy o potencjalnym istnieniu RNA wirusa SARS-CoV-2.

ORF1a to fragment genomu charakterystyczny dla SARS-CoV-2, ale może mutować. Natomiast proteina-N istnieje od miliardów lat w tej samej postaci, jest niezmienialna. To proteina, która ma bezpośredni kontakt z RNA i która chroni RNA wirusa.

Dlatego naukowcy arbitralnie postanowili, że w testach qRT-PCR będą szukać dwóch genów: ORF1a oraz proteiny-N. Jeśli ORF1a zmutuje, to cel badania się zmienia.

Ciekawostka: Proteina-N występuje we wszystkich koronawirusach, nie tylko w SARS-CoV-2.

qRT-PCR to najczulszy test z dwóch powodów:

  1. Szuka dwóch genów: ORF1a i proteiny-N.
  2. Potrafi replikować (amplifikować) nawet bardzo małe ilości DNA. Możemy więc wykryć wirusa nawet na samym początku choroby, kiedy jeszcze nie doszło do jej objawów klinicznych.

qRT-PCR jako złoty standard – dr Jan Żak

Często słyszę, że jeśli test qRT-PCR pokaże wynik dodatni, to na pewno tak jest. Chciałbym trochę zmienić nasze myślenie.

Zacznijmy od uświadomienia sobie, jak wiele warunków musi być spełnionych, aby uzyskać jakikolwiek wynik.


Pamiętajmy też, że genom wirusa od momentu pobrania ulega degradacji. Owszem, są doniesienia, że wirus potrafi przeżyć na blacie 4 godziny. Mogą istnieć mikrośrodowiska, które na to pozwalają. Świat RNA taki nie jest. Świat RNA jest pełny enzymów, które niszczą RNA oraz które oddziałują na wirusa. I może zdarzyć się tak, że pacjentka, mimo że jest chora, dostanie ujemny wynik, właśnie dlatego, że genom wirusa w trakcie realizacji badania uległ degradacji.

W celu zrealizowania badania qRT-PCR musimy podjąć wiele kroków.

1. Pobieramy próbkę
Jako biofizyk oraz lekarz patrzę na świat jako zainfekowany RNAse-ami – jak ktoś się poci, to widzę te enzymy, które będą niszczyły niechciane substancje, z którymi możemy się zderzyć.

RNAse to enzym-dinozaur, który istnieje od miliardów lat i jest praktycznie nie do zniszczenia. Aby go dezaktywować, musi być trzymany przez 4 godziny w temperaturze 200 °C. Występuje niemal wszędzie – we łzach, ślinie, śluzie, pocie, skórze, w bakteriach, grzybach. Jeśli ten enzym pojawi się w naszym otoczeniu, to osiądzie na rękawiczkach, ale będzie też w kurzu. Wystarczy, że dotkniemy ręką pobraną próbkę albo szczoteczką skórę nosa, by potencjalnie unieważnić badanie qRT-PCR. Mydło czy alkohol nie zniszczą tego enzymu.

2. Wymazówka do probówki
W probówce, do której wkładamy wymaz, znajduje się podłoże do przenoszenia wirusów, tzw. VTM (Viral Transport Media), które zawiera m.in. detergenty, chelatory i sole guanidyny To powoduje, że kwas nukleinowy odczepia się od tej bardzo silnie wiążącej proteiny-N. Detergenty rozpuszczają również membranę wirusa. Jest to konieczne, ale może mieć wpływ na RT oraz DNAse.

3. Transport
Test qRT-PCR może być wykonany tylko w akredytowanym laboratorium, do którego próbki muszą być dostarczone. Zajmuje to dodatkowy, cenny czas.

4. Przygotowanie do wykonania badania qRT-PCR
W laboratorium wykonujemy szereg czynności, które umożliwiają wykonanie testu PCR:

Zaczynamy od strawienia DNA, używamy DNAse.
Przez godzinę w 50 °C dezaktywujemy DNAse.
Zamieniamy RNA w cDNA.

5. Realizacja badania qRT-PCR

Summa summarum to wszystko nie jest takie proste. Cały proces badania próbki trwa minimum 2–3 godziny, a w rzeczywistości pandemicznej jeszcze dłużej. Laboratoria są obłożone pracą. Niektóre kliniki czekają 7 godzin, ale są też szpitale, które czekają nawet 2–3 dni na wynik.
To zdecydowanie za długo. Wyobraźmy sobie pacjentkę, która przyjeżdża do tzw. białego szpitala (czyli nie covidowego) i zaczyna rodzić. W takiej sytuacji nie ma czasu, by czekać na wynik badania. Personel musi reagować, ale może się też zarazić. Czas uzyskania wyniku jest kluczowy. Na tę potrzebę odpowiadają najnowsze testy antygenowe.
Testy qRT-PCR są jednak wciąż najczulszymi diagnostycznymi testami na rynku, ale w miarę rozwoju medycyny pojawiają się nowe, skuteczniejsze, charakteryzujące się dużą czułością testy przesiewowe, które sprawnie wspierają diagnostykę.

Test post factum. Test immunologiczny

  • Wykazuje przejście infekcji. Nie ma jednak potwierdzonych badań stwierdzających, że raz przebyta infekcja koronawirusem chroni przed kolejną.
  • Dzięki temu testowi możemy sprawdzić, czy mamy przeciwciała, a co za tym idzie, jako ozdrowieńcy możemy oddać osocze. Osoby chore na COVID-19 leżące w szpitalu bardzo go potrzebują.
  • Ten test nie sprawdzi się u kobiet w ciąży, które mają słabą reakcję immunologiczną.

IgM – Immunoglobulina typu M – wykrywa wczesną reakcję organizmu, co może oznaczać, że chorowaliśmy kilka dni wcześniej. Może więc wyjść wynik, który wskazuje: dodatnie IgM, a ujemnie IgG.

IgG – Immunoglobulina typu G – to przeciwiciała, które są bardziej specyficzne, np. przeciwko proteinie-S. Wytwarzają się po przebyciu choroby. Jeśli ktoś jest odporny na koronawirusa, to ma właśnie te przeciwciała.

Jakie będą poziomy antyciał u pacjentów, którzy bezobjawowo przeszli COVID-19?
Testy immunologiczne nie są stosowane jako testy skriningowe, przesiewowe. Z uwagi na to, że istnieje bardzo niska wczesna reakcja immunologiczna na SARS-CoV-2, to zmniejsza użyteczność tych testów do szerokiego skriningu. W momencie, gdy coraz więcej pacjentów przechoruje COVID-19, wtedy przydatność testów immunologicznych będzie większa.

Dlaczego? Większość osób przechodzi SARS-CoV-2 bezobjawowo, a to oznacza, że wykazuje bardzo małą reakcję immunologiczną na wirusa. Trudno więc oczekiwać, że znajdziemy markery immunologiczne.

Natomiast jeśli mieliśmy objawy takie jak: przeziębienie, kaszel, duszność, to jak najbardziej warto sprawdzić, czy wytworzyły się u nas przeciwciała. Wtedy będziemy mieć pewność, że chorowaliśmy na koronawirusa, a nie było to np. zapalenie oskrzeli albo przeziębienie.

Test, który dogania w czułości. Test antygenowy II generacji.

Testy antygenowe reagują na białko: proteinę-N. Ta molekuła występuje w największym stężeniu w całym wirusie, co potwierdza, że jest bardzo ważna.

  • Testy antygenowe I generacji (produkowane do sierpnia 2020 roku) – były niedoskonałe i nie powinny być stosowane.
  • Testy antygenowe II generacji (produkowane od września 2020 roku) – zostały zatwierdzone przez niezależne instytucje, mają wysoką czułość (ok. 90%) oraz bardzo wysoką swoistość (99,5%).

Wymaz do testów antygenowych możemy pobrać z nosa, a nie – tak jak w przypadku qRT-PCR – głęboko z nosogardzieli.

Test opiera się na takim samym mechanizmie, jak test ciążowy. Zamiast barwnika wykorzystana jest nanomolekuła złota, dzieki której pojawia się na teście charakterystyczny czerwony koloryt. To jest całkiem rozsądne: barwnik mógłby się zdegradować, złoto jest trwałe.

Dr Jan Żak: – Gdy pobieram pacjentce wymaz do testu antygenowego, to wiem dokładnie, jak go pobrałem. Próbka jest przede mną. Kontroluję wszystkie parametry i biorę odpowiedzialność za prawidłowe wykonanie testu. Mogę zareagować w ciągu 20 minut. Podczas gdy na test qRT-PCR czekam nawet 7 godzin. W sytuacji, kiedy wynik testu jest niejednoznaczny, musimy wykonać ponowny test qRT-PCR po 24 godzinach, czyli 7 godzin plus 24 godziny plus kolejne 7 godzin to ok. 38 godzin czekania na wynik. A są szpitale, w których trwa to nawet kilka dni.

Publikacje podają, że czułość testów antygenowych może być trochę mniejsza. Jednak z badań klinicznych dotyczących nowszej generacji API COVID-RAPID (poniżej opis wyników badania) wynika, że testy te potrafią uzyskać wynik o podobnej czułości i swoistości co test qRT-PCR. Uwzględniając długi czas oczekiwania na wynik oraz wysoką proporcję testów qRT-PCR, które są sztucznie negatywne, uważam, że szybkie testy antygenowe są lepiej przystosowane oraz niezbędne do pracy w ostrym trybie.

Wiele razy, gdy przewoziłem pacjentkę z izby przyjęć na porodówkę, to z uśmiechem deklarowałem: “Zrobiłem pacjentce test antygenowy. Jest ujemna!”. Zupełnie inaczej się z taką pacjentką postępuje. Stres jest o wiele mniejszy. Oczywiście, zawsze jest ryzyko, dlatego jesteśmy ostrożni, ale owe ryzyko jest znacznie mniejsze, a komfort pracy nieporównywalny. Taki test to kluczowy pomocnik, który sprawia, że możemy wykonywać naszą pracę w klinice.

Czy krótka droga od próbki do wyników testu antygenowego, w porównaniu z długą drogą qRT-PCR, może dać wyniki te same lub lepszej czułości i swoistości, co wynik qRT-PCR?

Oczywiście! Idąc dalej: z qRT-PCR możemy działać po 7 godzinach, a z testem antygenowym po 20 minutach. Czasem lepiej jest zrobić test z szerszym spektrum czułości dwa razy w tygodniu, niż jeden perfekcyjny test raz na dwa tygodnie. Powinniśmy wykorzystać tę metodę badania jak najlepiej. To pozwoli lekarzom normalnie funkcjonować w szpitalach oraz zmniejszyć ilość utraty personelu medycznego, który zakazi się w okienku 7-godzinnym oczekiwaniem na wynik qRT-PCR.

I oczywiście, dla pewności i bezpieczeństwa powinniśmy łączyć testy antygenowe z qRT-PCR. Medycyna musi się opierać na całokształcie badań laboratoryjnych, ocenie pacjenta i doświadczeniu klinicznemu. Widząc wynik ujemny, a jednocześnie dostrzegając, że pacjentka ma objawy, nie możemy jej traktować jako ujemnej.

Testy przyszłości: wystarczy 1 sekunda

Pandemia sprawiła, że nastąpił skokowy wzrost technologii, które wspierają wczesną diagnostykę. Prawdopodobnie już wkrótce pojawi się w Polsce nowa technologia – SpectraLIT, która działa z wykorzystaniem spektrofotometrii wspartej przez sztuczną inteligencję. Dzięki niej test na koronawirusa trwa 1 sekundę! Ta opracowana w Izraelu technologia wykorzystuje analizę spektralną próbki śliny pobranej od testowanych osób. Samo pobranie jest proste – trzeba przepłukać gardło solą fizjologiczną a ślinę wypluć do próbnika, który jest umieszczony w przenośnym spektrometrze. Ten w sekundę dokonuje analizy widma i podaje wynik o bardzo wysokiej wiarygodności: test o 95% czułości i 100% swoistości. Wsparcie analizy obrazu zapewnia sztuczna inteligencja. Dodatkowe atuty tej technologii to niska cena i możliwość natychmiastowego przesyłania danych do chmury. System pozwala na analizę każdego patogenu, niezależnie od mutacji.

Prof. Mariusz Zimmer – KOMENTARZ

PROF. MARIUSZ ZIMMER

Testy antygenowe to tama, która pozwoli lekarzom dobrze funkcjonować. To narzędzie, które umożliwi zablokowanie napływu pacjentów covidowych do białych szpitali. To wymóg chwili – potrzebujemy tych testów tu i teraz.
Kilka dni temu została przyjęta na oddział rodząca pacjentka. Była w 12. dniu kwarantanny. Według obecnych ustaleń kwarantanna trwa 10 dni i nie musimy robić ponownego testu. Mamy jednak taki zwyczaj, że testujemy. Pobraliśmy więc wymaz, ale traktowaliśmy ją jako osobę zdrową. O godzinie 22.00 przyszedł wynik qRT-PCR i okazało się, że pacjentka ma COVID-19. Czyli przez ok. 11 godzin z potencjalnie zakaźną pacjentką miały styczność dwa zespoły położnych, lekarzy, ale też salowe i noszowi. Oczywiście, chronimy siebie. Zachowujemy reżim sanitarny. Nosimy maski i przyłbice. Ale jako lekarze musimy wiedzieć, czy pacjentka jest COVID+ czy COVID-.

Czy będziemy wiedzieć w 100%? Nie. To trzeba sobie jasno powiedzieć. W medycynie nie ma rzeczy zero-jedynkowych. Jest za to: „najbardziej prawdopodobne”.

Testy, które mają czułość i swoistość ponad 90%, są jednak bezsprzecznie konieczne w naszych szpitalach.

Uzyskanie takiej informacji wstępnej ma kardynalne znaczenie w postępowaniu ostrodyżurowym i oczekiwaniu na test qRT-PCR. Nie zlikwidujemy testu PCR, on ma swoją ugruntowaną pozycję. Natomiast w czasie tego okna, czyli gdy czekamy na wynik, powinniśmy mieć do dyspozycji testy antygenowe.

Badanie kliniczne antygenowych testów API Covid-Rapid Antigen – w skrócie

Podsumowanie wyników:

  • Porównanie testu tzw. testu płytkowego API Covid-Rapid Antigen firmy API Pharma USA LLC z testem qRT-PCR
  • 100 testów, w tym tylko jeden różnił się z wynikiem testu qRT-PCR
  • W 4 przypadkach po 15 minutach wynik był jednoznacznie ujemny, natomiast test PCR po pierwszej próbie był wątpliwy i należało wykonać u tych pacjentek ponownie test PCR. Po kolejnych 10 godzinach dał również wynik ujemny. Ta różnica czasowa 15 minut względem 20 godzin, przy tak dużej czułości, jest podstawową zaletą wykonywania powyższych testów.
  • Analogicznie: u 3 pacjentek bezobjawowych, w rutynowym postępowaniu, po 15 minutach otrzymaliśmy wynik dodatni To kazało nam odizolować je do czasu otrzymania po 10 godzinach wyniku testu PCR potwierdzającego obecność u tych pacjentek wirusa SARS-CoV-2.

Postęp medycyny jest ogromny. W kwietniu jeszcze takich testów nie było. Teraz, po tych kilku miesiącach mamy do nich dostęp. Testy antygenowe powinny wejść na stałe do naszej praktyki.

Opinia i stanowisko dotyczące zasadności stosowania szybkich testów antygenowych w kierunku SARS-CoV-2 w oddziałach położniczych

Wobec stale zwiększającej się liczby pacjentek bezobjawowych z dodatnim wynikiem na COVID-19, istnieje pilna konieczność wdrożenia do schematu postępowania medycznego szybkich testów antygenowych na obecność w organizmie wirusa SARS-CoV-2.

Jest to wymóg konieczny, mający na celu zapewnienie bezpieczeństwa pracy i zdrowia personelu medycznego oraz pacjentów w każdej placówce medycznej. Takie postępowanie dotyczy wszystkich oddziałów, ale przede wszystkim oddziałów pracujących w trybie ostrodyżurowym, przyjmujących nagłe przypadki, tj. takie, które wcześniej nie miały szans poddać się badaniu metodą PCR w kierunku wirusa SARS-CoV-2.

Okres oczekiwania na wynik badania PCR jest zdecydowanie za długi, przez co metoda ta staje się bezużyteczna w pracy ostrodyżurowej. Oczekiwanie od minimum 7–10 godzin do jednej, a nawet dwóch dób, jest nie do przyjęcia w sytuacjach, kiedy należy podjąć natychmiastowe działania medyczne.

Do tej grupy pacjentów należą przede wszystkim kobiety w ciąży i rodzące. Przyjęcie każdej ciężarnej do oddziału położniczego lub na salę porodową bez określenia jej statusu epidemicznego stanowi zagrożenie dla jej zdrowia, zdrowia personelu i innych kobiet rodzących.

Szybki test, tzw. test płytkowy API Covid-Rapid Antigen firmy API Pharma USA LLC, pozwala po 15–20 minutach określić z dokładnością blisko 100% (dane firmy i piśmiennictwo naukowe określają czułość dla SARS-CoV-2 na 93%) status epidemiczny pacjentki pod kątem obecności wirusa SARS-CoV-2. Jest optymalnym, wręcz koniecznym testem, który powinien posiadać każdy oddział medyczny, a szczególnie położniczy.

II Katedra i Klinika Ginekologii i Położnictwa USK we Wrocławiu, dzięki uprzejmości firmy Mobile SCANMED Systems Sp. z o.o., autoryzowanego przedstawiciela firmy API Pharma USA LLC, dostała w darze 100 sztuk powyższego testu antygenowego do samodzielnego wykonania w celu oceny jego przydatności w działalności Kliniki.

Okazało się, że zgodność otrzymanych wyników z powyższego testu antygenowego z wynikami typowego testu PCR była bliska 100%. Wynik można było odczytać po 15–20 minutach. Łatwość przeprowadzenia badania pozwala na jego wykonanie bez specjalistycznego szkolenia, jak również nie wymaga on użycia jakiegokolwiek dodatkowego oprzyrządowania.

Po dokonaniu wymazu z otworu nosowego – niekoniecznie z nosogardzieli, jak przy teście PCR, zakropieniu go odpowiednim roztworem, a następnie umieszczeniu kilku kropel na płytce, ukazuje się jednoznaczny wynik obecności lub braku obecności antygenu wirusa SARS-CoV-2.

Należy podkreślić, że ten test wykrywa obecność antygenu, a nie przeciwciał, co stanowi jego znaczną zaletę.

Dane firmy i piśmiennictwo naukowe wykazują ok. 93% czułości powyższego testu, co potwierdziły nasze obserwacje na 100 próbkach. W 4 przypadkach uzyskaliśmy po 15 minutach wynik jednoznacznie ujemny, natomiast test PCR po pierwszej próbie był wątpliwy i należało go wykonać u tych pacjentek ponownie. Po kolejnych 10 godzinach dał również wynik ujemny. Ta różnica czasowa 15 minut względem 20 godzin, przy tak dużej czułości, jest podstawową zaletą wykonywania powyższych testów.

Analogicznie: u 3 pacjentek bezobjawowych, w rutynowym postępowaniu, po 15 minutach otrzymaliśmy wynik dodatni. To kazało nam odizolować je do czasu otrzymania po 10 godzinach wyniku testu PCR potwierdzającego obecność u tych pacjentek wirusa SARS-CoV-2. Takie postępowanie zmniejszyło do minimum kontakt z zakażonymi pacjentkami i pozwoliło na podjęcie bezpiecznych epidemicznie działań.

Mając świadomość, że aktualnie testem rozstrzygającym jest test PCR, wykonywanie szybkich antygenowych testów pozwoliłoby w dużej mierze utrzymać sprawność oddziału, jak i zachować specjalną czujność u pacjentek dodatnich, do czasu otrzymania ostatecznego wyniku. Pozwoliłoby to na bezpieczną dla wszystkich organizację pracy oddziałów szpitalnych, przychodni, gabinetów lekarskich i innych placówek zdrowia oraz uniknięcie masowych zakażeń personelu medycznego z pełnymi tego konsekwencjami.

Prof. dr hab. Mariusz Zimmer

Jesteś pracodawcą i zatrudnisz lekarza zakładowego? Zamów testy antygenowe

API Covid Rapid Antigen to wiarygodne testy antygenowe 

 

Wierzymy, że testowanie pomoże nam szybciej uporać się z pandemią, ale ważnym orężem – oprócz dystansu i dezynfekcji – jest również wiedza, i to wiedza ze sprawdzonych źródeł.